分子信標探針是核苷酸序列（DNA 和 RNA 的組成部分），用于熒光檢測特定 DNA 或 RNA 序列的存在。分子信標（圖 1）的設計使得序列末端的少量核苷酸堿基（5 到 7 個）彼此互補并配對形成所謂的莖。莖的形成產生了***個未配對堿基的環，稱為莖環或發夾環。***后，在核苷酸序列的***端有***個共價連接的熒光團，而在序列的另***端有***個熒光猝滅劑。當分子信標處于這種發夾形式時，猝滅劑通過 F?rster 共振能量轉移 (FRET) 猝滅極大地減少了熒光團的熒光。

圖1：分子信標探針

與分子信標具有互補堿基的核苷酸序列稱為互補 DNA (cDNA)。在cDNA 存在的情況下，分子信標發夾將打開并與 cDNA 雜交形成雙鏈序列（圖 2）。這種雜交導致猝滅劑和熒光團進***步分開，從而熒光團發射不再被猝滅。通過監測來自熒光團的熒光變化，可以識別和量化 cDNA 的存在。

圖2：分子信標和cDNA之間的反應，其中a）是cDNA，b）分子信標，c）雜交雙鏈序列。

分子信標探針可以定制設計以靶向特定的 DNA 或 RNA 序列，從而允許分子信標用于 DNA 和 RNA 的實時檢測和定量。主要用于PCR 定量、體內 RNA 檢測、病原體檢測、病毒載量定量和研究核酸-蛋白質相互作用。分子信標的使用，加上靈敏的熒光光譜儀和樣品溫度控制，有助于測量極低濃度的 DNA 或 RNA。

分子信標探針及cDNA 購自于默克公司。所有數據均從配有 SC-27 （4位溫度控制樣品模塊） Edinburgh Instruments FS5 熒光分光光度計獲得。SC-27 用于在單獨攪拌的同時加熱四種具有不同濃度 cDNA 和分子信標的溶液。配置100 nM 的分子信標以及0 nM、20 nM、40 nM 和 60 nM cDNA 溶液。

cDNA和分子信標之間的雜交可以在信標處于閉合發夾形式時發生，但會緩慢進行?？梢酝ㄟ^加熱分子信標以打開發夾結構來加速雜交。當加熱時，發夾結構的莖堿基對之間的吸引力被克服，這被稱為變性，并且發夾打開。可以使用溫度依賴性熒光研究此開口的溫度依賴性（圖 4）。

將具有不同 cDNA 濃度的分子信標的四種溶液移至比色皿中并放置在 SC-27 的四個位置。為了促進 cDNA 和信標序列的雜交，將溶液通過在 60°C 加熱并在該溫度下保持 20 分鐘進行溫育。然后冷卻回 20°C 并在該溫度下再保持 20 分鐘。這種加熱和冷卻的孵化過程增加了分子信標和 cDNA 之間的雜交率，如圖 5 所示。

圖8：cDNA已知濃度樣品（橙色點）和未知cDNA濃度樣品（紅圈）的校準曲線。

Edinburgh Instruments FS5 熒光分光光度計用于使用分子信標探針以nM量***確定未知濃度的 DNA，與此同時，使用 SC-27 四位溫度控制樣品模塊孵育 DNA 和探針溶液，并自動測量四種溶液的熒光強度，***后使用 FS5 Fluoracle ?軟件的定量分析功能分析測試結果。

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