脂質納米顆粒（LNP）是體內***的系統交付用于治療應用的小干擾RNA（siRNA）。LNP siRNA系統的配制需要將含有陽離子脂質的溶液與含有siRNA的溶液快速混合。當前的配制程序采用宏觀混合工藝來生產直徑70 nm或更大的系統，這些系統具有可變的siRNA封裝效率，均質性和可重復性。在這里，我們顯示了允許在納升***進行毫秒混合的微流體混合技術，可重復生成極限大小為20 nm或更大的LNP siRNA系統，并在多態性指數低至0.02的廣泛條件下基本上完全包封了siRNA。通過微流混合產生的優化的LNP siRNA系統在小鼠肝細胞中以10 μg / kg siRNA的劑量水平實現了50％的靶基因沉默。

脂質納米顆粒（LNP）是治療應用中用于體內遞送小干擾RNA（siRNA）的主要系統。LNP siRNA系統可以在多種動物模型中通過靜脈注射沉默治療相關基因，并且正在臨床試驗中用于心血管疾病、肝癌和其他疾病的治療。目前已經開發了幾種制造LNP siRNA的方法，包括將預先形成的囊泡（PFVs）與siRNA混合或使用T型管混合器將溶解在乙醇中的脂質與siRNA水溶液混合。這些方法產生直徑為70nm或更大的LNP，其siRNA封裝效率為65-95%。然而，由于宏觀混合方法會導致局部混合速率不均勻，因此往往會產生具有高多分散性和批間重復性差的LNP。微流控混合技術允許毫秒***納升***別的快速混合，在本文中我們展示了利用微流控混合技術來可靠地制備之前無法實現的LNP siRNA系統。我們采用了簡單但高效的微流控設備——交錯人字形微混合器（SHM），相對于其他微混合器幾何結構具有更高產量，使其適用于大規模生產LNP-siRNA。

微流體混合導致單分散LNP的產生。
結構化混沌平流（SHM）提供了***種在中等雷諾數條件下（2 < Re < 500）對兩個輸入流進行可重復和非常快速混合的方法。在將兩個流體流組合后，它們通過***系列人字形結構，誘導旋轉流，使得流體相互包裹，并且方向在半個周期之間變化。這導致了***個混沌的流動特征，其特點是指數***地縮小了兩個液體之間的特征擴散長度，并實現了快速的平流混合。當總流量為2毫升/分鐘時，本文采用的SHM可以在3ms內實現完全混合。

為了開發LNP siRNA的制造工藝，我們采用了基于先前研究的測試配方，其中使用PFV和T管混合工藝制備LNP-siRNA系統。脂質組成包括可離子化陽離子脂質(DLinKC2-DMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、膽固醇和PEG-lipid，其中陽離子脂質含量范圍為40至60 mol%，PEG-lipid含量為1至5 mol%。siRNA/總脂質比保持在0.06 (wt/wt)。DLinKC2-DMA具有明顯pKa值為6.76，在低pH（例如pH 4.0）下能夠與siRNA形成復合物，并且在生理pH下使LNP表面電荷接近中性，從而減少毒副作用。測試配方由DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA按40:11.5:47.5:1摩爾比組成，并且siRNA/lipid比例為0.06 (wt/wt)。隨后改變PEG-lipid含量、陽離子脂質含量和/或siRNA/lipid比例以優化LNP尺寸或效力。

我們***先研究了自組裝混合（SHM）在***系列溶質濃度下，是否能夠產生具有確定大小的單分散LNP siRNA系統。我們假設，在足夠快的混合速率下，由于介質極性迅速上升而沉淀形成的脂質納米粒子(LNP)將采用與組分分子物理特性相容的***小或“極限大小”。因此，在更快的流速下，提供逐漸縮短的混合時間，預期將產生越來越單分散的極限大小LNP siRNA系統。我們從測試配方中以總流量0.02到4 ml/min生成LNP siRNA系統。通過動態光散射測量得出，在流速高于0.2 ml/min時，LNP直徑保持恒定約55 nm（數字加權模式；反映從表觀LNP分子量得出的平均直徑）。然而，在***高總流速4 ml/min時，針對終端siRNA濃度范圍為0.25 mg/ml至0.59 mg/ml實現了多分散性指數(PDI)為0.03或更小、高度單分散的“極限大小” LNP siRNA 系統。

微流控混合器的并行化允許LNP制造規模化。
***個可行的LNP siRNA配方過程也必須是可擴展的。由于反應總體積增加時會出現質量傳輸差異，因此放大規模可能具有挑戰性。微流控混合的固有優勢在于可以通過并行化混合設備輕松擴展（見圖1b）。為了證明這***點，我們使用了***個具有六個并行SHM元件的裝置來生產由1-棕櫚酰基-2-油酰基PC（POPC）/膽固醇組成、每分鐘72毫升或580毫克LNP/min 的極限尺寸LNP。據我們所知，這是迄今為止使用微流控方法演示的***高速率的LNP合成，并且與替代放大工藝相比表現良好。

通過微流控混合生成的LNP siRNA系統在體內表現出強大的基因沉默作用，這是非常重要的。
我們需要證明，與以往技術生成的系統相比，這些由微流控混合產生的LNP siRNA系統具有同等或更高的效力。迄今為止，報道中***有效的siRNA制劑是使用DLinKC2-DMA陽離子脂質，并優化了陽離子脂質比例和siRNA/脂質比值，通過T管合成制備而成的LNP系統。已經證實，在小鼠FVII模型中，這些LNP siRNA系統可以達到50%基因沉默效果，并且劑量水平低至0.02 mg siRNA/kg體重。因此，在小鼠FVII模型中***先測量了由微流控混合產生的LNP FVII-siRNA系統在不同陽離子脂質量下的基因沉默效力，并其次作為siRNA/脂質比值函數進行測定。

本研究的結果表明，微流體混合裝置中含有SHM可以用于生成可預測“極限”大小的LNP系統。siRNA能夠有效地封裝在這些系統中，并且所產生的LNP siRNA系統在體內展現出優異的基因沉默能力。我們將此處呈現的結果與以往使用微流體混合技術形成LNP系統進行了區分，然后討論了使用微流體混合設備形成LNP和LNP siRNA系統的機制，并***終指出了采用SHM幾何形狀進行微流體混合相比以往宏觀混合程序制定LNP siRNA系統時的優勢。

已經做出相當大量工作來利用微流體混合（主要是通過水動力學聚焦幾何）生成脂質和聚合物納米顆粒，或者包含質粒DNA的脂質復合物。雖然結果令人鼓舞，但存在***些局限性，例如所生成材料大小和數量方面存在限制。例如，在水動力學聚焦下產生50nm直徑極限尺寸系統只有在30或更高的流速比下才能實現，在這種情況下會導致較大程度上材料稀釋。而我們所提供的結果則證明了SHM可以產生高量（500mg/min）符合極限尺寸范圍為20-100nm LNP siRNA 系統，并且通過簡單改變PEG-脂質含量即可控制其極限尺寸。

***后值得注意到，在我們完成本文準備階段時Chen等人發表文章指出他們也利用微流體混合技術并采用SHM 微攪拌器來小規模生產各種類型 LNP siRNA 配方, 以確定適于 vivo 傳遞新組分. 這項工作采用低流速(~0.3ml/min)，低封裝效率(~80%) 和70-80nm 的 LNP 大小。

關于微型化過程允許形成 LNP 和包含 LNP 的siRNA 的機理問題, 我們感興趣兩個點：***先是如何形成100 nm 或更小 LNPC；其次是如何使得siRNAs 可以接近*** 封裝效率。 關于LNPs 形成, 混勻速率顯然是***個重要參數。乙醇 - 脂溶液與水緩沖液快速混勻導致介質極性迅速增加, 導致整個 水平達到高超飽和狀態 , 結果快速均勻核化納米顆粒 。 這些核化事件非常迅捕捉時間標度對顆粒形態/結構影響不穩定亞 極限大小顆粒 ，隨后 合并 成 枝界線 大小 顆 粒子 ，由 組件 提供 的空間約束 決 定 顆 粒 子 大 小 。適 當選擇 脂 類 組件 及 其 相 對 數 量 ， 其 后 控 制 擴 散進入進***步 生長。

關于微流體工藝允許LNP和含LNP的siRNA形成的機制，有兩個值得關注的點：***先是形成100 nm大小或更小的LNP的機制，其次是siRNA可以以接近***的效率被封裝的機制。關于LNP的形成，混合速率顯然是***個重要參數（如在本文和其他研究中所示）。乙醇-脂溶液與水緩沖液快速混合導致介質極性迅速增加，在整個混合體積內使脂質單體高度過飽和，從而迅速且均勻地產生納米顆粒。這些核化事件比顆粒形成/聚集時間尺度快得多，并導致非熱力學穩定亞限尺寸顆粒的形成。隨后這些亞限尺寸顆粒會凝聚形成限定尺寸顆粒，而顆粒大小由提供組分所施加出來的空間位阻和能量約束決定。適當選擇脂質組分及其相對數量可控制***終LNP大小（正如本文通過改變PEG-lipid量來展示；PEG-lipid優先存在于LNP外部并賦予穩定性，并通過進***步脂質單體結合抑制了后續生長）。

觀察到采用微流體混合技術配制的LNP siRNA系統表現出接近*** 的siRNA 封裝效率, 這表明隨著介質極性增加, 具有陽離子脂類物質沉淀下來與siRNA核酸發生初期反應, 隨后再經過進***步增加極性時被PEG-lipid包裹. 如前所描述, 這種模型符合低溫透射電鏡觀測到 LNP siRNA 系統呈現“固態核心”電子密集外觀, 與雙層囊泡系統不同之處在于后者呈圓形結構且內部電子密度較低. 分子建模方法以及這些 LNP siRNA 系統所展現出來密度等物理特徵也支持了納米結構脂數字核心存在.

值得注意的是，像SHM混合器這樣的在線混合技術要求脂質在所使用的有機溶劑中可溶。在乙醇中溶解性較差的脂質可能需要加熱溶劑以達到足夠的溶解度，或者可以采用其他水相容性有機溶劑。SHM等微流體混合器可以由多種對大多數溶劑具有耐受性的材料構建。

與之前使用宏觀混合技術（如PFV方法和T管混合技術）進行LNP siRNA合成相比，微流體配方過程具有幾個優勢。通過微流控工藝制備LNP siRNA系統能夠實現更高的封裝效率、生產更小型號的LNP系統，并且能夠以小規模批量生產而幾乎沒有損失（設備死體積約為1 μl）。此外，不需要生產PFVs。

與T管混合器相比，微流控方法還包括以下優勢：能夠生產直徑小于50納米（T管法報道***小直徑為50納米）的更小型號系統，并且使用低于1 ml/秒以上的高流速來實現快速混合并非必需。而微型攪拌器允許在明確定義、可重復條件下以較低流速進行LNP siRNA配方，在此情況下由于死體積少和簡單地準備了用于LNP優化和離體測試等小規模批次而導致損失很少。

通過將微流控攪拌設備并行化，從臺式試驗制備轉向大規模LNP siRNA制造也是***個主要優勢。

總之，在本文呈現結果表明利用SHM微型攪拌器進行微流控攪拌使得20-100 納米范圍內 LNP siRNA 系統常規生產成為可能，并且提供易設計、低聚分散度、高siRNA封裝效率、改進可伸縮性及與先前工藝相當甚至更好基因沉默效力等諸多優點。形成直徑為 50 納米或更小 LNP 的能力十分重要, 因為這類系統展示出穿透靶組織(例如腫瘤) 能力增強；同時，在三倍以上低比例下形成 LNP 系統亦顯著促進了理想規模上 LNP 生產. 預計采用 SHM 進行 微 流 控 混 合 將 成 為 實 驗 室 和 臨 床 規 模 下 的 LN P 合 成 技 術 。

圖1. 采用交錯人字形微混合器(SHM)的脂質納米顆粒(LNP)小干擾RNA(siRNA)制劑策略示意圖。(a)乙醇中的脂質和水溶液中的siRNA通過注射泵被泵入微流體混合裝置的兩個入口。人字形結構誘導層流的混沌平流，導致乙醇和水相的快速混合，并相應地使脂質溶液的極性迅速增加。在臨界極性下沉淀形成LNP。(b)微流體混合器的并行化，以便在保持相同生產條件的同時實現制劑規模化。這是通過垂直(i = 1, 2，..)和水平(j = 1, 2，...) 的混合器復制實現的，通過芯片上的管道進行流體處理。混合通道的尺寸為200 μm × 79 μm，人字形結構為31 μm高和50 μm厚。

圖2. 交錯人字形微混合器(SHM)的總流量較高降低脂質納米顆粒(LNP)小干擾RNA(siRNA)的多分散性。多分散性指數(PDI)分別依賴于總流量和乙醇和水相中脂質和siRNA的濃度。PDI由動態光散射(DLS)提供的累積分析中的二階系數確定(PDI = (σ/μ)2)。總流量從0.02到4 ml/min，保持水緩沖液與乙醇體積流量比在3:1恒定。水siRNA濃度從0.25到0.59 mg/ml，而脂質濃度從~4到10 mg/ml，保持siRNA/總脂質比在0.06 wt/wt恒定。PDI值代表4次測量的平均值。所采用的脂質成分為DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA，摩爾比為40:11.5:47.5:1.水緩沖液為25 mmol/l醋酸鹽，pH 4.DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿。

圖3. 增加PEG-c-DMA含量產生逐漸更小的脂質納米顆粒(LNP)小干擾RNA(siRNA)系統。(a) 在快速混合條件下(4 ml/min總流量，siRNA緩沖液：脂質-乙醇體積流量比為3:1)產生的PEG-c-DMA含量對LNP大小的影響。LNP由DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA組成，摩爾比分別為40:11.5:47.5:1, 40:11.5:46:2.5，和40:11.5:43.5:5,PEG-c-DMA分別為1,2.5，和5 mol%。LNP的siRNA-總脂質比為0.06 wt/wt。(b) 隨著LNP大小從42 nm降至26 nm，通過增加PEG-c-DMA含量從1 mol%到5 mol%，封裝效率。在測量封裝前，LNP樣品在磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析。封裝是指使用陰離子交換自旋柱去除游離siRNA后，LNP中存在的siRNA百分比。(c) 隨著LNP大小從54 nm降至28 nm，通過增加PEG-c-DMA含量從1 mol%到5 mol%，LNP的多分散性。如圖2圖例所述，確定了多分散指數(PDI)。(d)空LNP的大小作為PEG脂質含量的函數，其范圍為0.25-5 mol%。LNP由DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA組成，DLinKC2-DMA和DSPC分別保持在40和11.5 mol%。PEG-c-DMA的滴定通過調整膽固醇來補償。所有LNP均在脂質-乙醇相中以初始脂質濃度20 mmol/l生產，然后與pH 4的25 mmol/l乙酸緩沖液混合。數字加權平均直徑顯示了對PBS透析后LNP的平均直徑，以去除殘留的乙醇，并將pH值提高到7.4。誤差柱表示平均值的標準差(n = 3)。DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿。

圖4. 脂質納米顆粒(LNP)小干擾RNA(siRNA)的配方采用微流控混合，在廣泛的siRNA-陽離子電荷比范圍內高效封裝。LNP由Dlin-KC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA組成，摩爾比為40:11.5:47.5:1,siRNA-總脂質比為0.06 wt/wt。總流速維持在2 ml/min，使用10 mmol/l的脂質-乙醇相混合含有siRNA的水緩沖液(25 mmol/l醋酸鹽，pH 4)。封裝是指使用陰離子交換自旋柱去除游離siRNA后，LNP中siRNA的百分比。誤差條表示從三個LNP配方測量的封裝標準偏差。DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿。

圖5. 含1和5 mol% PEG-c-DMA的脂質納米顆粒(LNP)小干擾RNA(siRNA)系統的冷凍透射電子顯微鏡(cryo-TEM)顯微圖。(a)由DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA(摩爾比40:11.5:47.5:1)和siRNA組成的LNP siRNA的cryo-TEM顯微圖(wt/wt)。(b)由DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA(摩爾比40:11.5:43.5:5)和siRNA組成的LNP siRNA的cryo-TEM顯微圖(wt/wt)。LNP在50K放大率下成像。LNP配方在快速混合條件下(4 ml/min總流量，siRNA緩沖液：脂質-乙醇體積流量比為3:1)用交錯人字形微攪拌器(SHM)進行，乙醇相含有30 mmol/l脂質。成像前濃縮LNP siRNA分散體。刻度條代表100 nm。DSPC,1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿。

圖6. 脂質納米顆粒(LNP)小干擾RNA(siRNA)基因沉默效能的優化，作為陽離子脂質含量和siRNA/總脂質比的函數，在FVII小鼠模型中。(a) LNP DLinKC2-DMA含量對FVII小鼠模型中FVII基因沉默的影響。在靜脈注射含有40到60 mol% DLinKC2-DMA的LNP siRNA系統24小時后，監測FVII表達。PEG-c-DMA含量保持在1 mol%，陽離子脂質的添加通過降低DSPC和膽固醇含量來補償，保持DSPC與膽固醇的比值保持在0.25(mol/mol)。(b) siRNA/總脂質比變化對FVII小鼠模型中FVII基因沉默的影響。所使用的脂質成分為DLinKC2-DMA/DSPC/膽固醇/PEG-c-DMA(摩爾比60:7.5:31.5:1)。siRNA/總脂質比從0.01到0.35(wt/wt)變化，分別對應于siRNA與陽離子脂質荷電比為0.025、0.25、0.5和1。通過尾靜脈注射向小鼠系統性給藥LNP siRNA(n = 3/劑量水平)。注射后24小時收集血液，用比色法測定因子VII水平。

(文章來源于儀器網)