圖1 通過 Echo進行PCR體系構建。

Gibson DNA連接方法是合成生物學中使用***多的技術，它可以組裝從DNA序列至小基因組重疊DNA片段大小，優點是它與序列無關并生成無痕DNA連接產物。Golden Gate DNA連接方法利用TypeIIS限制性內切酶和連接酶組合來組裝DNA片段。正如我們先前所介紹的***樣，使用Echo聲波移液，能夠實現這兩種***步式DNA連接反應的降本增效，可在250 nL、500nL和1000 nL反應體積下實現Gibson的正確組裝，效率可與手工實驗相媲美或優于20 μL反應，這使試劑成本降低20倍以上；Golden Gate可實現50 nL 、250 nL和500 nL規模反應體積的DNA（手工實驗時通常為 15 μL反應）成功組裝，效率同樣高于手工實驗對照，使試劑用量至少降低30倍。

生物合成途徑的闡明和重構以及調控回路和網絡的工程設計，都需要蛋白質功能的知識。植物***直被用作生物活性和高價值天然產物的來源，但由于植物之中大型基因***族的普遍存在，使得將特定功能與單個蛋白質聯系起來具有挑戰性，同時也面臨需要付出大量努力來優化表達和純化方案進行蛋白質表征這***技術瓶頸。Biofoundry的獨特優勢能夠加速“設計-構建-測試-學習”周期的能力，可加速優化并實現酶活性的快速篩選；無細胞蛋白質合成（CFPS）結合了DNA模板、能量源、氨基酸、核苷酸三磷酸 （NTP） 和過量輔因子，以及含有翻譯機制的粗裂解物，是***種成熟的體外快速蛋白質生產工具，顯著優勢是能夠直接進行功能分析，而無需耗時的細胞破碎和純化方案，同時還適用于自動化和小型化，減少操作錯誤和CFPS反應中的可變性，促進主動學習引導的反應條件優化，并普遍增加實驗的通量，***大限度地減少DBTL循環中的“構建”時間。SynTrack是***個基于web的工作流程驅動的bioCAM平臺，用于管理和跟蹤DNA制造過程。SynTrack導入boost指定的構建過程信息，其中包括操作人員（利用機器人平臺）執行所有“構建”操作的分步說明。SynTrack可以為液體處理機器人（如Biomek FX和Echo平臺）生成移液指令，自動將接收到的DNA片段重新排列到孔板中。通過Echo自動化平臺構建2μL反應體積（手動為20μL）進行***步法Golden Gate DNA組裝反應，隨后構建2μL CFPS反應體系進行蛋白表達，通過熒光素酶（該標簽可輕松去除）快速定量蛋白表達水平，隨后無需蛋白純化即可使用游離蛋白質合成反應產物進行多種功能表征。

圖2 Biofoundry輔助DNA組裝和植物蛋白游離蛋白合成（CFPS）的工作流程。編碼目的蛋白的0***DNA部分（模塊）可以組裝成用于CFPS或在植物中表達的功能表達質粒。使用Echo篩選蛋白質變體的文庫，使用 HiBiTLgBiT熒光素酶發光實驗定量確定***佳表達構型。

使用Echo聲波移液配合無細胞蛋白合成（CFPS）技術也可在96和384孔板中進行代謝工程檢測，通過Wood-Ljungdahl通路耦合的反向β氧化（r-BOX）通路，實現如C4-C6酸和醇生化產物的負碳合成，具有降低全球CO2排放的巨大應用潛能。正是由于模式生物大腸桿菌無細胞轉錄-翻譯（TXTL）在DNA定向體外蛋白質合成的應用范圍越來越大，***些實驗室也開發了全大腸桿菌TXTL工具箱，并通過Echo實現了流程自動化。另***個無細胞合成生物應用方向是非模式生物體外原型設計和快速表征代謝途徑，加速體內生物合成途徑測試，使例如梭狀芽胞桿菌等非模式生物能夠利用可再生資源（木質纖維素生物質或CO和H₂合成氣）生產更多高價值產品。使用DNA組裝設計自動化軟件J5進行結構設計和生成實驗運行worklist，發送至Echo自動化平臺以2 μL體積進行Golden Gate DNA組裝，可同時進行多達6個部分（三個獨特啟動子和終止子序列的開放閱讀框）的組裝，效率高達90%；這***質粒系統將為非模式生物提供體外和體內生物合成途徑的簡單測試框架，從而縮短開發周期。非模式生物巨雙歧桿菌的天然無細胞（NCF）轉錄翻譯平臺的快速建立也借助了Echo，并和貝葉斯模型參數推斷方法相結合，可以在數小時內對基因表達工具進行嚴格的表征，并且這個平臺還有望擴展到***系列其他重要的底盤微生物的合成生物學應用。

圖3 使用兼容的無細胞載體系統組裝三基因構建體的Golden Gate。（a）Golden Gate組裝工作流程的示意圖，包括自動化組裝，包括質粒的計算設計、Echo自動化液體處理操作指令、質粒組裝和質粒確認。（b）含有構建的梭狀芽孢桿菌表達載體的六個克隆中的質粒組裝的PCR鑒定。

圖4 非模型微生物的無細胞原型設計。（A）在NCF中使用內源性能量再生和轉錄-翻譯組分測試合成的基因表達質粒。（B）在B. megaterium NCF中使用MGapt（mRNA）適配體和GFP進行平行轉錄-翻譯測定。（C）借助Echo液體處理工作站，用于快速篩選無細胞反應的半自動化工作流程。

微生物系統中異源生產的特定高價值化學物質大多需要資源密集型分析過程（如HPLC和MS）進行定量，較低的分析通量使DBTL循環遇到了***定的瓶頸。而生物傳感器通常與基因表達系統耦合，為此人們越來越關注開發熒光生物傳感器用于合成生物學中，來檢測小分子和物理信號。通過為Echo編寫Python移液腳本，構建384或1536孔板的10μL或2μL熒光酶標檢測體系，基于大腸桿菌雙鍵還原酶（EcCurA）非特異性結合后熒光極大增強的特性，開發了***種熒光復合物直接蛋白質（DiPro）生物傳感器，作為微生物異源姜黃素酶促合成的檢測單元，且不需要任何額外的基因表達后步驟或特定的蛋白質成熟要求。同樣，使用Echo進行小反應體系的熒光素酶化學發光體系構建，高通量篩選分析脯氨酰寡肽酶異源表達變異株，將金屬響應開關整合到蛋白質中，也為精確調節蛋白質功能提供了新的機會。

圖5 Ni(II)依賴的開關