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由CompuCyte開發(fā)的新的細胞分析儀-激光掃描細胞儀(Laser Scanning Cytometer, LSC)，以多組參數(shù)分析細胞及形態(tài)，是當今世界上***先進的細胞生物學分析儀器,在細胞生物學、免疫學、病理學、藥理學、遺傳學、腫瘤學等領(lǐng)域已成為新***代強有力的研究工具,受到了生物醫(yī)學界的極大關(guān)注, 已成為***內(nèi)外的***個注目點。 

定量細胞內(nèi)物質(zhì)及組織掃描

多時段同點分析

適應(yīng)多種樣本類型，包括：

組織

 粘附細胞

具有完整的顯微鏡功能 

流式細胞儀已在全世界廣泛應(yīng)用。然而，仍有許多任務(wù)流式細胞無法完成，比如檢測細胞粘附、相隔時間重復檢測同***細胞和在細胞上或胞內(nèi)定位探針染色位置。流式細胞儀很難檢測只含有數(shù)百個細胞的樣本，而此問題在檢測只含有數(shù)百個細胞的多達1536個微孔時更加復雜了。***些儀器如共聚焦顯微鏡和微板掃描圖像系統(tǒng)可作高分辨分析及提供其他分析功能，但只能提供低通量分析并要求操作者經(jīng)驗豐富。激光掃描細胞儀,它可以進行低分辨分析，像流式細胞儀***樣對散射光和熒光進行多參數(shù)檢測，從而提供高通量的分析。 

LSC應(yīng)用：

關(guān)鍵應(yīng)用示例

任何基于細胞學的研究

任何組織切片的研究 

細胞周期和DNA含量分析: 抗原表達, 免疫分型 

多元化分析：

凋亡

遷移

細胞活性

膜電位 

細胞周期信息由生物化學及形態(tài)學信息構(gòu)成。

細胞周期可通過直接檢測DNA的含量來獲知。 

對生物學樣本的多色分析: 因LSC具備了高通量的能力，在生物學單細胞分析領(lǐng)域和細胞分析學中已變得越來越重要。結(jié)合不同的技術(shù)與染色方法，可對任何***個單細胞的多色分析。對于細胞分析來說，玻片式細胞儀（SBC）是實現(xiàn)這種技術(shù)的理想工作，它不像流式細胞儀，它沒有任何損耗，如樣本是被固定的載玻片上的并能夠重復進行染色并檢測。方法和結(jié)果：我們在激光掃描細胞儀上（Laser Scanning Cytometer）進行了多種多色熒光分析實驗。其中包括了不同的實驗過程，（1）多色細胞分相反，對***份樣本使用八種或更多熒光素進行染色；（2）重復染色，使用同***熒光標記的不同抗體進行染色后逐***分析；（3）熒光淬滅，根據(jù)熒光的不同淬滅特征進行不同的淬滅實驗；（4）熒光激活，激活不同的熒光顆粒或染料；（5）光化裂解（裂解FRET染料）。通過LSC的重定位功能，可以以1um的精度對樣本中的同***細胞重復定位，從而經(jīng)過不同處理的樣本可再次進行分析。結(jié)論：給合各種方法與技術(shù)，可在單細胞水平上進行多色熒光分析。 

同時分析多個樣本中細胞對于培養(yǎng)物的反應(yīng)在生物實驗及化療效果評估中有重要作用。在此我們使用LSC來對多孔藥物誘導凋亡進行分析檢測。材料：使用2-MNOH或其他常用的化學藥物來誘導細胞凋亡。我們分析了96孔中經(jīng)熒光標記的細胞凋亡情況。結(jié)果：我們證實LSC是***種在單細胞水平同時比較分析不同孔內(nèi)細胞在不同時間及藥物濃度情況下的變化。結(jié)論：這些數(shù)據(jù)有力說明了LSC適合于在單細胞水平同時、多參數(shù)分析不同細胞群體對藥物的反應(yīng)。

LSC，尺寸大約與研究級臺式流式細胞儀相同大小，是當前制作最為精細的激光掃描細胞儀，可檢測由標準488nm氬離子激光器激發(fā)的綠色(530-nm), 橙色 (580-nm),和紅色 (610-nm) 熒光；由488nm或633nm氦氖激光器激發(fā)的遠紅(670-nm) 和近紫外 (750-nm)熒光。藍色熒光素(460nm)可由400nm紫羅蘭半導體激光器激發(fā)，綠色氦氖激光器(543-nm)也可選配。

LSC儀器檢測為高分辨放大模式，一個典型的細胞圖像包含有上百個像素。

在LSC上，激光聚焦光束（通常為空冷488nm氬離子激光或633nm氦氖激光）通過檢流計驅(qū)動的一組透鏡來獲得光束的直徑，然后經(jīng)過顯微鏡的長通濾片，從而在標本上形成2.5至10nm直徑的光束。

檢流計是由一個“鋸齒”信號來控制，它的振幅隨時間呈線性增長隨后又快速恢復初始值。當在線性信號部分時，激光聚焦光束在標本平面上呈線性移動。此線性移動的長度在171和685um之間，由物鏡的放大率決定。激光束方向的熒光信號由顯微鏡的物鏡收集，隨后通過二向色濾片，然后經(jīng)過不同帶寬的濾光片分離進入其各的光電倍增管。光電倍增管信號以規(guī)律性的間距數(shù)字化，從而形成一組數(shù)據(jù)與0.5um掃描間距相一致的像素。在每一掃描線末端，顯微鏡的載物平臺與掃描垂直的方向移動0.5um，然后整個過程重復進行。如此，儀器便可生成矩形掃描區(qū)域內(nèi)一個或多個熒光的數(shù)字影像。LSC還集成了一個前向散射光信號，使用顯微鏡鏡臺下冷凝器來收集光信號，然后由一個光敏二極管來檢測光散射信號，與流式細胞儀類似，前向方向也有一擋且擋穿透的激光。大角度散射光在實驗機上可檢測，但在現(xiàn)有的商品機中還不可用。

在流式細胞儀中，探測器或前置放大器輸出的是***組脈沖信號，細胞在隨意的時間里經(jīng)過檢測點形成了信號之間隨意間隔；細胞的光散射信號和熒光信號可由脈沖信號的高度和面積或?qū)挾葋肀硎尽Ｔ诖蠖鄶?shù)儀器中，收集的信號被轉(zhuǎn)化并存儲為脈沖信號，擁有高度、面積和寬度值，然后由電子計算機轉(zhuǎn)化這些信號作進***步分析。信號隨著不規(guī)則的間隔（由細胞檢測的隨機時間決定）而被數(shù)字化并記錄下來。
在激光掃描細胞儀中，探測器或前置放大器所輸出的信號是***個對樣本***定區(qū)域的光柵掃描信號，并以衡定的間隔被數(shù)字化，所產(chǎn)生的是數(shù)字矩陣信號，其中包括了***幅圖片的***個原素或像素。有關(guān)***個細胞的數(shù)據(jù)以***個數(shù)量***的連續(xù)像素來表示；這個數(shù)量***在低分辨系統(tǒng)時可能是10，而在高分辨系統(tǒng)中會達到100。然而，盡管激光掃描細胞儀的圖像有效像素會小至與高分辨數(shù)字顯微鏡***樣（0.5um），但它的空間分辨率會低些，因為激光的聚焦光束大于***個像素的空間。

激光光束特性

激光作為細胞儀的光源是因為它所輸出的激光能被聚焦成為很小斑點。然而，根據(jù)激光基礎(chǔ)物理學，聚焦光斑越小，在光束聚焦后的光路上發(fā)生的散射越快。這個現(xiàn)象在共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡中都會發(fā)生，而它們典型的光斑< 1um，聚焦深度不到***個微米，并且聚焦光斑在每個檢測點上會快速上下移動。這樣便可在薄的標本切片上獲得高分辨率熒光圖像或三維結(jié)構(gòu)圖。典型的流式細胞儀聚集光斑的尺寸50-120um寬—形成***個比樣本流寬的穩(wěn)定的光束；光斑的高度為5-50nm；更窄的聚焦光束可得到更為詳細的有關(guān)細胞尺寸的信息，但因光線的發(fā)散，會使在極小角度收集散射光的步驟復雜化。激光光斑寬度和高度的臨界尺寸在幾百微米左右。當光束高度比細胞小時，流式細胞儀的空間分辨率好；當光束增大趕到比細胞大幾倍時，分辨率降低直至無信號出現(xiàn)。

在激光掃描細胞儀中，聚焦光斑，或腰部（***細處，典型的為2.5-10um）界于流式細胞儀和共焦之間。聚焦的深度為100um，可在載玻片或毛細管中形成并收集統(tǒng)***的信號。盡管圖像的像素之間有間隔（0.5-4um），但視覺的分辨率卻不高，因為聚焦光斑（2.5-10um）比像素本身要大。